Informacije

Ali lahko glukozo zamenjate z glicerolom v celičnih medijih?

Ali lahko glukozo zamenjate z glicerolom v celičnih medijih?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Da bi nahranili an živalska celica v procesu imenovan Dihanje, ali lahko zamenjam glukozo z glicerolom?

Spodnja enačba: glicerol + kisik -> voda + ogljikov oksid


V večini primerov ni dobra ideja zamenjati glukoze z glicerolom v gojišču živalskih celic. Živali imajo sposobnost presnove glicerola po poti, ki se začne z encimom glicerol kinazo. Vendar pa je glicerol kinaza izražena le v določenih vrstah celic, kot so celice jeter in celice ledvic.

Reference:

http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=2.7.1.30 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22591/


Presnova molekul, ki niso glukoza

Spoznali ste katabolizem glukoze, ki zagotavlja energijo živim celicam. Toda živa bitja za hrano porabijo več kot le glukozo. Kako sendvič s puranom, ki vsebuje različne ogljikove hidrate, lipide in beljakovine, zagotavlja energijo vašim celicam?

V bistvu se vse te molekule iz hrane pretvorijo v molekule, ki lahko nekje vstopijo v pot celičnega dihanja. Nekatere molekule vstopijo pri glikolizi, druge pa v ciklu citronske kisline. To pomeni, da se vse katabolne poti za ogljikove hidrate, beljakovine in lipide sčasoma povežejo v glikolizo in poti cikla citronske kisline. Presnovne poti je treba obravnavati kot porozne – to pomeni, da snovi vstopajo iz drugih poti, druge snovi pa odhajajo na druge poti. Te poti niso zaprti sistemi. Mnogi produkti na določeni poti so reaktanti v drugih poteh.


Povzetek

Alkohol je bistvenega pomena za značaj vina, vendar ga lahko preveč spravi v neravnovesje. Vino se šteje za dobro uravnoteženo, če se njegova alkoholna moč, kislost, sladkost, sadnost in taninska struktura medsebojno dopolnjujejo, tako da nobena posamezna komponenta ne prevladuje v okusu. Uravnotežiti pozitivne sadne okuse vina z optimalno absolutno in relativno koncentracijo alkohola je lahko presenetljivo težko. V zadnjih treh desetletjih so potrošniki vedno bolj zahtevali vino z bogatejšimi in zrelejšimi profili okusa sadja. V odgovor so proizvajalci grozdja in vina podaljšali čas trgatve, da bi povečali zrelost grozdja in povečali stopnjo okusa sadja in intenzivnost barve. Vendar pa višja stopnja zrelosti grozdja povzroči povečano koncentracijo grozdnega sladkorja, kar posledično povzroči povišano koncentracijo alkohola. V povprečju se je delež alkohola v rdečih vinih iz številnih toplih vinorodnih regij po vsem svetu v tem obdobju povečal za približno 2 % (v/v). Ne glede na to, da so mnoga od teh „polnega telesa in sadja“ dobro uravnotežena in iskana, obstaja tudi pomemben segment potrošniškega trga, ki išče lažje sloge z manj „pekoče“ iz etanola v okusu. Proizvajalci vina, ki so osredotočeni na potrošnike, razvijajo in izvajajo več strategij v vinogradu in kleti za zmanjšanje koncentracije alkohola v vinih, pridelanih iz dobro zrelega grozdja. V tem kontekstu Saccharomyces cerevisiae vinski kvas so se izkazali za ključno strategijo za zmanjšanje tvorbe etanola med fermentacijo grozdnega mošta z visoko vsebnostjo sladkorja (> 240 g l -1 ). Eden od pristopov je bil razvoj sevov kvasovk z nizko vsebnostjo alkohola, ki delujejo tako, da svojo presnovo ogljika preusmerijo od proizvodnje etanola k drugim presnovkom, kot je glicerol. Ta članek obravnava trenutne izzive proizvodnje glicerola na račun etanola. Prav tako meče novo luč na programe razvoja sevov kvasovk, ki bi lahko, podprti s sintetično genomiko, potencialno premagali te izzive.


PpNrg1 je transkripcijski represor za zatiranje glukoze in glicerola AOX1 promotor v metilotrofnem kvasu Pichia pastoris

Regulator zatiranja glicerola Pichia pastoris AOX1 promotor (P AOX1) še vedno ni jasno.

Rezultati

A Cys2Njegovo2 transkripcijski represor cinkovega prsta PpNrg1, lokaliziran v jedru in je sodeloval pri zatiranju P AOX1 v P. pastoris v glukozi in glicerolu. Kvantitativni PCR v realnem času je razkril, da je PpNrg1 zaviral ekspresijo številnih genov, ki sodelujejo pri uporabi metanola in biogenezi peroksisoma v 0,02 % glukoze in 1 % (v/v) glicerola. Test elektroforetskega premika mobilnosti in test odtisa DNase I sta pokazala, da se je PpNrg1 vezal na pet mest P AOX1, vključno z dvema veznima mestoma PpMxr1, ki je nepogrešljiv aktivator P AOX1 v P. pastoris.

Zaključek

Transkripcijski represor PpNrg1 zavira P AOX1 v glukozi in glicerolu z neposredno vezavo na pet mest P AOX1, vključno z dvema veznima mestoma transkripcijskega aktivatorja PpMxr1.


Kriokonzervacija zarodkov in zarodkov plavuti in školjk

3.4 Izbira podaljška in krioprotektorja

Podaljški in krioprotektanti so bili zelo dobro raziskani, saj je krioprezervacija brez njih težavna. Poleg semenske tekočine in univerzalnega krioprotektanta, DMSO, drugih posameznih krioprotektantov, kombiniranih krioprotektantov, krioprotektantov z jajčnim rumenjakom ali saharozo so bili uporabljeni pri krioprezerviranju gameta, blastomerov, nauplijev ali zarodkov. Zdi se, da je pri zahtevah po razširitvah izrazita specifičnost vrste.

Rumenjak kokošjega jajca je bil preizkušen kot dodatek v podaljšku ali krioprotektantu v številnih študijah krioprezervacije. Pri morskih ribah sta Erdahlova in Grahamova raztopina ter jajčni rumenjak pokazali pozitiven učinek na mleko severne ščuke, Esox lucius L., s povečano stopnjo oploditve (Babiak et al., 1995). v kobiji, Rachycentron canadum10 % DMSO s 3 mM glukoze in 10 % jajčnim rumenjakom je dalo približno 100 % gibljivost semenčic po 1 letu krioshranjevanja pri -80 °C (Caylor et al., 1994). Chereguini idr. (1997) je v rombu za kriokonzerviranje zmešal tudi DMSO z rumenjakom (Scophthalmus maximus) sperme. Spermatozoje romba je mogoče z visoko stopnjo uspešnosti tudi kriokonzervirati v raztopini saharoze z 10 % DMSO in 10 % jajčnim rumenjakom. V sladkovodnih ribah, kot je Donavski losos (Hucho hucho), 10 % DMSO + 10 % jajčni rumenjak + 0,3 M glukoza + 25 mM KCl je bil najprimernejši za krioprezervacijo mlečne mase, kar je povzročilo 87,5 % očesnih jajc (Glogowski et al., 1997a). Ciereszko et al. (1993) so primerjali dva kombinirana krioprotektanta in ugotovili, da 8 % DMSO z 10 % jajčnega rumenjaka daje bistveno višjo stopnjo oploditve kot 20 % glicerol z 0,3 M glukoze pri rumenem ostrižu, Perea flavescenshile. Lahnsteiner et al. (1996b) je nadalje poudaril, da je dodatek jajčnega rumenjaka (7 %, 20 % celotnega volumna polnila) in saharoze (0,5 %) znatno povečal kakovost šarenke (Oncorhynchus mykiss) semena v primerjavi z istim dodatkom DMSO in glicerola ali DMSO, glicerola in propandiola brez teh dodatkov. Čeprav so številne študije pokazale pozitiven učinek uporabe jajčnega rumenjaka kot podaljška, morda ne bo uporabno za druge vrste. Piironen (1993) je ugotovil, da je dodatek jajčnega rumenjaka kot podaljška za krioprezervacijo sperme povečal stopnje oploditve potočne postrvi (Salmo trutta m. lakustris L.), vendar ne v Artie charr (Salvelinus alpinus L.). v asp, Aspius aspius, je prisotnost jajčnega rumenjaka v polnilih znatno zmanjšala uspešnost krioprezervacije (Babiak et al., 1998). Zaščitno delovanje rumenjaka je očitno specifično za vrsto in je lahko odvisno od sestavin podaljška in postopka kriokonzervacije.

V nekaterih nedavnih študijah, N,N-dimetil acetamid (DMA) in N, N-dimetilformamid (DMF) smo uporabili kot alternativne krioprotektorje. Wayman et al. (1996) so ocenili štiri kemikalije kot krioprotektorje pri kriokonzervaciji pegave postrvi (Cynoscion nebulosus) spermo in ugotovili, da so DMA, metanol in glicerol slabši od 10 % DMSO. De Baulny idr. (1997) je poskusil tudi DMA pri kriokonzerviranju šarenke (O. mykiss) sperme, vendar ni uspelo. V primeru spermatozoida medaka, Aoki et al. (1997) so navedli, da so bili najboljši rezultati doseženi z uporabo 50 μl fetalnega govejega seruma, dopolnjenega z 10 % DMF kot krioprotektantov. Testi oploditve so pokazali, da je mogoče doseči stopnje oploditve 96–100 % in stopnje izvalitve 84–100 %. Njihova študija prvič ponuja praktično metodo za ohranjanje spermatozoida medaka.

Pri kriokonzerviranju sperme pacifiških ostrig, C. gige, je bila visoka stopnja oploditve 45,9 % dosežena v študiji z uporabo raztopine, ki vsebuje 8 % DMSO, 50 mM saharoze in 6 mM reduciranega glutationa kot krioprotektorja in zamrzovanja mlečne mešanice v hlapi tekočega dušika (Usuki et al., 1997). Isto poročilo je pokazalo, da so spermatozoidi, ki so bili kriokonzervirani 4 leta, pokazali manjšo sposobnost preživetja kot kratkotrajno kriokonzervirane sperme. Razmerje med normalnimi ličinkami v obliki črke D in stopnjo preživetja 6 dni po oploditvi je bilo 78,0 % oziroma 77,4 % z uporabo sperme, kriokonzervirane 4 leta.

Harvey (1983a,b) je poročal o učinkovitosti metanola kot razredčila za spermo tilapije in cebrice. Za kriokonzerviranje orade smo uspešno uporabili razredčilo s pH 7,35 in osmotskim tlakom sperme 375 mosM/1, ki preprečujejo gibljivost semenčic (Spa. aurata) sperme pri −196 °C (Chambeyron in Zohar, 1990).


Zaključki

Alternativni bioproces za proizvodnjo etanola iz biomase je bil uspešno razvit z uporabo seva, ki je bil gensko spremenjen za vklop ali izklop izrabe glukoze v E. coli s temperaturnim stikalom, s čimer se razbremeni inhibicijski učinek glukoze na izkoriščanje drugih sladkorjev. Celice, ki so izklopljene z uporabo glukoze, lahko prednostno uporabljajo ksilozo in druge sladkorje, prisotne v lignoceluloznih hidrolizatih, za rast celic, medtem ko celice, ki so vklopljene z uporabo glukoze, lahko učinkovito pretvorijo glukozo in druge sladkorje v etanol med anaerobno fazo za fermentacijo etanola. Pomembno je, da se je izboljšala učinkovitost izrabe sladkorjev v lignoceluloznih hidrolizatih in s tem tudi ekonomska izvedljivost proizvodnje etanola iz biomase.


Povzetek

Visoka stopnja odvisnosti od fosilnih goriv je eden večjih problemov, s katerimi se sooča sodobne družbe. d -Glukoza in glicerol sta se v zadnjih letih pojavila kot možna nadomestila za fosilna goriva, ki se uporabljajo pri proizvodnji kemikalij visoke vrednosti, pri takih procesih pa naj bi imele ključno vlogo poti bioproizvodnje brez celic. Pred kratkim je bilo opisanih več sintetičnih kaskad, ki se uporabljajo za biotransformacije d-glukoze in glicerola brez celic v piruvat in več. Vendar so bili ti omejeni z zelo počasnim korakom dehidracije d-glicerata v piruvat, ki ga katalizira dehidrataza iz Sulfolobus solfataricus (SsDHAD), zaradi česar je ta korak daleč glavno ozko grlo. Z združevanjem velikega števila razpoložljivih genomov s pristopom odkrivanja, ki temelji na zaporedju, smo identificirali zaporedja podpisov, ki vodijo do odkritja dveh ločenih razredov dehidrataz, ki kažejo obetavno aktivnost in skupno število prometa (TTN) proti d-gliceratu. Zlasti dehidrataza iz Paralcaligenes ureilyticus (PuDHT) je pokazal >100-krat večjo aktivnost in TTN za d-glicerat v primerjavi z SsDHAD. poleg tega PuDHT je pokazal izjemno visoko aktivnost in TTN proti d-glukonatu. Zamenjava za SsDHAD od PuDHT v našem modelu kaskade od d-glukoze do etanola je povečal stopnjo proizvodnje 10-krat in dosegel 92-odstotni teoretični izkoristek pri 50 °C. PuDHT je bil primeren tudi za pretvorbo glicerola v piruvat pri sobni temperaturi, kar je vodilo do >5-kratnega izboljšanja stopnje proizvodnje v primerjavi s sistemom, ki uporablja SsDHAD pri 50 °C in dosegel 97 % teoretičnega izkoristka. PuDHT je bil združljiv tudi, ko je bil kot substrat uporabljen surovi glicerol, in ni več povzročal ozkega grla v encimski kaskadi.


Metabolični inženiring Escherichia coli za povečanje proizvodnje acetola iz glicerola

Acetol, C3 keto alkohol, je pomemben intermediat, ki se uporablja za proizvodnjo poliolov in akroleina. Za povečanje proizvodnje acetola iz glicerola z Escherichia coli, je bil mutant (HJ02) konstruiran z zamenjavo domačega glpK gen z alelom iz E. coli Lin 43 in prekomerna ekspresija yqhD, ki kodira aldehid oksidoreduktazo YqhD, ki pretvori metilglioksal v acetol. V primerjavi s kontrolnim sevom brez glpK HJ02 je imel 5,5-krat večjo proizvodnjo acetola in 53,4 % višjo stopnjo porabe glicerola. Nato je bila kot sosubstrat dodana glukoza, da se poveča razpoložljivost NADPH in ptsG gen je bil izbrisan v HJ02 (HJ04), da bi ublažil represijo ogljikovega katabolita, kar je povzročilo 30-odstotno povečanje ravni NADPH in NADPH/NADP + . Posledično se je v HJ04 nabralo do 1,20 g/L acetola, kar je 69,0 % več kot pri HJ02. Poleg tega je vrzel A gen v HJ04 je utišala protismiselna RNA (HJ05), da bi dodatno povečala proizvodnjo acetola. Koncentracija acetola, ki jo proizvaja HJ05, je dosegla 1,82 g/L, kar je bilo 2,1 in 1,5-krat višje kot pri HJ02 in HJ04.

Analiza PCR v realnem času kaže, da je bil katabolizem glukoze preusmerjen iz glikolize na oksidativno pentozofosfatno pot v HJ05.

To je predogled vsebine naročnine, dostop prek vaše ustanove.


Materiali in metode

Sevi, mediji in rastni pogoji

Uporabljeni sevi in ​​plazmidi so navedeni v tabeli 2 in tabeli S1. V preglednicah S2, S3, S4 in S5 so navedeni uporabljeni oligonukleotidi. Kulture smo gojili pri 37°C v LB. Selekcija mutantov je vključevala antibiotike ampicilin (100 μg ml −1), kloramfenikol (25 μg ml −1), kanamicin (50 μg ml −1, ko so bili geni odpornosti na plazmidih in 25 μg ml −1 za gene na kromosomih), apramicin ( 50 μg ml -1 ) in nourseothricin (10–40 μg ml -1 , pridobljeno od Jena Bioscience GmbH, Jena, Nemčija). M9 minimalni medij (Sambrook et al. 1989) je bil uporabljen z 0,4 % (m/v) glukoze ali glicerola. Za biotransformacijo je bil uporabljen modificiran M9hP (M9 visok ali 100 mmol l -1 fosfat): 500 ml 1·15x soli M9hP, 0,5 ml 0,1 M CaCl2, 0,5 ml 1 M MgSO4, 0,2 ml 10 mg ml -1 tiamina. Osnovna raztopina soli 1,15x M9hP je bila sestavljena iz 20,47 g Na2HPO4· 2 H2O, 15,65 g KH2PO4, 1,15 g NaCl, 2,30 g NH4Cl in 2 l H2O.

Sev ali plazmid Ustrezni geni/lastnostia a (Amp R), (Apr R), (Cml R), (Kan R) ali (Nou R) = odpornost na ampicilin, apramicin, kloramfenikol, kanamicin ali nourseotricin aac(3)IV = aminoglikozid-3-N- gen za acetiltransferazo, bla = β- gen za laktamazo, mačka = gen kloramfenikol acetiltransferaze, nat1 = gen nourseotricin acetiltransferaze.
Referenca ali konstrukcija
Sevi
BW25113 lacI q rrnBT14 ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78 Datsenko in Wanner ( 2000 )
WA66x BW25113 Lac + ΔxthA::FRT Wegerer, A., IIGb b IIG = Inštitut za industrijsko genetiko, Univerza v Stuttgartu
ss173 WA66x ΔldhA::FRT-aac(3)IV-FRT ΔpoxB::FRT ΔpflB::FRT P1 (MW4) x (ss171)c c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
ss195 WA66x ΔpykF::FRT ΔpykA::FRT-kan-FRT ΔldhA::FRT ΔpoxB::FRT ΔpflB::FRT ΔtdcE::FRT-aac(3)IV-FRT P1 (ss145) x (ss182)c c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
ss251 ss195 (izbran za hitrejšo rast na glicerolu, prenos #16) Serijski odlomki
ss271 ss251 ΔgldA::mrpS-nat1-mrpS P1 (ss262) x (ss251)c c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
ss274 ss251 Δpps::mrpS-nat1-mrpS P1 (ss266) x (ss251)c c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
ss279 ss251 ΔgldA::mrpS ss271 (pJOE5555·1)d d (pJOE5555·1) Odstranitev označevalca odpornosti z lokalno specifično rekombinacijo med dvema mrpS mesta z uporabo plazmidno kodirane rekombinaze MrpA.
ss281 ss251 ΔmgsA::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss231) x (ss279)c c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
ss310 ss251 ΔmaeA::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss296) x (ss279)c c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
ss374 ss251 Δppc::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss225) x (ss279)c c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
ss431 ss251 ΔmaeB::mrpS-nat1-mrpS ΔmaeA::mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss415) x (ss430)
Plazmidi
pCP20 flp bla (Amp R) mačka (Cml R) repA101 Čerepanov in Wackernagel (1995)
pIJ773 FRT-aac(3)IV-FRT (R. april) bla (Amp R) sunek et al. ( 2003 )
pIJ790 mačka (Cml R) repA101 araC λ-RED (gam, bet, exo) sunek et al. ( 2003 )
pJOE5555·1 Prha-mrpA mačka (Cml R) repA101 Altenbuchner, J., IIGb b IIG = Inštitut za industrijsko genetiko, Univerza Stuttgart
pJOE6038·1 Dodatno recA na plazmidu pIJ790 Altenbuchner, J., IIGb b IIG = Inštitut za industrijsko genetiko, Univerza v Stuttgartu
pWA38·4 bla (Amp R) mrpS-kan-mrpS (Kan R) Wegerer, A., IIGb b IIG = Inštitut za industrijsko genetiko, Univerza Stuttgart
pSS55·11 bla (Amp R) mrpS-nat1-mrpS (Nou R) Izmenjava gena odpornosti v pWA38·4
pSS57·2 bla (Amp R) mrpS-aac(3)IV-mrpS (R. april) Izmenjava rezistentnega gena v pSS55·11
  • a(Amp R), (Apr R), (Cml R), (Kan R) ali (Nou R) = odpornost na ampicilin, apramicin, kloramfenikol, kanamicin ali nourseotricin aac(3)IV = aminoglikozid-3-N- gen za acetiltransferazo, bla = β- gen za laktamazo, mačka = gen kloramfenikol acetiltransferaze, nat1 = gen nourseotricin acetiltransferaze.
  • b IIG = Inštitut za industrijsko genetiko, Univerza Stuttgart
  • c P1 (A) × (B) = P1-transdukcija genov iz seva A v sev B
  • d (pJOE5555·1) Odstranitev označevalca odpornosti z lokalno specifično rekombinacijo med dvema mrpS mesta z uporabo plazmidno kodirane rekombinaze MrpA.

Konstrukcija delecij genov z λ-Red rekombinacijskim sistemom

Delecije kromosomskih genov so bile konstruirane z uporabo rekombinacijskega sistema λ-Red (Baba et al. 2006) in E. coli sev WA66x pJOE6038·1. WA66x je Lac + derivat BW25113, pridobljen s transdukcijo P1 (neobjavljeno). Plazmid pJOE6038·1 je derivat rekombinacijskega plazmida pIJ790, ki ima E. coli recA gen, integriran poleg λ-Red ekso, stavi in gam geni. Odporne genske kasete, ki so obkrožene z mesti specifičnimi rekombinacijskimi mesti za rekombinaze, FLP in MrpA, so bile pomnožene iz naslednjih plazmidov: pWA38·4 (mrpS-KmR-mrpS), pIJ773 (FRT-aac(3)IV-FRT), pSS55·11 (mrpS-nat1-mrpS) in pSS57·2 (mrpS-aac(3)IV-mrpS). Oligonukleotidi, uporabljeni za brisanje genov, so povzeti v tabeli S3. Elektroporacija WA66x pJOE6038·1 je bila izvedena, kot je opisal Gust et al. (2003). Kromosomske regije s kasetami za odpornost na antibiotike in ustreznimi izbrisi genov, ki so vgrajene v E. coli WA66x pJOE6083·1 so transducirali z uporabo bakteriofaga P1kc kot je opisal Lennox (1955). Za preverjanje smo bakterijsko kolonijo, vzeto z LB agarne plošče, resuspendirali v 100 μl vode in centrifugirali, celice pa smo resuspendirali v 100 μl vode in shranili pri -20 °C do nadaljnje uporabe. 5 μl te suspenzije smo pomnožili s PCR (50 μl reakcijske prostornine) v skladu z navodili proizvajalca z uporabo Taq DNA polimeraze. Analiza delecij in zamenjav genov pykA, pykF in tdcE s PCR v sevih ss195, ss251, ss279 in kot kontrola v ss173 je prikazano na sliki S1.

Izrezovanje kaset genov za odpornost na antibiotike

Plazmid pCP20, ki vsebuje temperaturno občutljiv replikon, ki omogoča toplotno indukcijo sinteze FLP, je bil uporabljen za izrezovanje genskih kaset odpornosti na antibiotike, ki jih spremljajo FRT najdiščih, kot sta jih opisala Cherepanov in Wackernagel (1995). Isti postopek smo uporabili za plazmid pJOE5555·1, ki nosi gen za rekombinazo. mrpA in mrpS mesta, ki spremljajo genske kasete za odpornost na antibiotike (Warth et al. 2011). Izraz oz mrpA je bil induciran z dopolnitvijo plošč z 0,2 % (m/v) l-ramnoze. Več podrobnosti o tej in drugih uporabljenih metodah lahko najdete v študiji Söllnerja (2012).

Določanje stopnje rasti

Nočno kulturo v mediju M9 smo uporabili za inokulacijo kultur v 100-ml Erlenmeyerjeve bučke, napolnjene s 15 ml rastnega medija, ki je kot vir ogljika vseboval glukozo ali glicerol. Antibiotikov niso dodali. Bučke inkubiramo pri 37°C [Gio Gyrotory® Shaker NBS (Edison, NJ, ZDA) pri c. 200 obr. min −1] je bila začetna gostota celic med 0,01 in 0,1 OD600. Nastali parameter μ (h −1 ) označuje največjo hitrost rasti na uro na bazo e.

Aerobna selekcija za hitrejšo rast na glicerolu

Kot izbor hitrejše rasti, pykAF mutant ss195 smo večkrat gojili v mediju M9 z glicerolom. Začenši s predkulturo v M9 z 0,4 % glukoze, smo cepili 100 ml medija M9 z 0,4 % glicerola v 500-ml stresalni bučki pri OD600 0,01 (transfer #1) in inkubiramo aerobno pri 37°C. Ko je OD600 Približno 1, celice ponovno prenesemo v nov medij. Volumen inokuluma za naslednjo kulturo smo prilagodili glede na hitrost rasti kultur, tako da so naslednje kulture lahko dosegle gostoto celic 1 OD600 v roku 24 ur.

Ponovno zaporedje celotnega genoma in analiza podatkov

Obremenitev E. coli ss251 je sekvencirala GATC Biotech AG (Konstanz, Nemčija) na platformi Illumina/Solexa SBS. Posamezni odčitki (tako v smeri naprej kot nazaj) so bili dolgi 51 bp, podatki o zaporedju so bili analizirani s programskim paketom Geneious Pro trial 5.6.5 (Biomatters Ltd., Newark, NJ, ZDA). Odčitki so bili preslikani na referenčni genom E. coli K12 MG1655 (pristopne številke: NC_000913.2/GI:49175990), nato pa je bilo izvedeno iskanje izmenjav in delecij nukleotidov.

Majhen test biotransformacije v 1,5-ml plastičnih skodelicah

5-ml kultura čez noč v M9 z 0,4 % glukoze in ustreznim antibiotikom je bila uporabljena za inokulacijo 15-ml predkulture v 100-ml bučki, ki vsebuje M9, dopolnjen z 0,4 % glicerola kot vir ogljika (v primeru sevov). ss310 in ss431 je bila predkultura dodatno dopolnjena z 10 mmol l -1 piruvata). Kulturo inkubiramo 4 ure pri 37 °C do gostote celic c. 0,6 OD600 je bil dosežen. Celice smo peletirali in resuspendirali v 5 ml 1,15x M9hP brez vira ogljika in shranili na ledu. Raztopino za biotransformacijo smo pripravili z mešanjem celic z 1,15 x raztopino M9hP, 150 μl 20 % (w/v) glicerola in 600 μl 1 M NaHCO3 do končne prostornine 6 ml (1x M9hP). Celična gostota standardnega testa biotransformacije je bila 0,5 OD600. Alikvote po 1,2 ml smo prenesli v 1,79-ml plastične skodelice in pokrove tesno zaprli (preostali zračni prostor = 0,59 ml), da smo ustvarili anaerobne ali mikroaerobne pogoje. Plastične skodelice smo inkubirali pri 37°C (rotator, Neolab, c. 10 vrt. min -1, polmer 10 cm) in se odpre samo enkrat, da se določi gostota celic in analizirajo zunajcelični presnovki z uporabo HPLC. Celice smo peletirali in supernatant shranili pri -20 °C za nadaljnjo analizo.

Analitiko

Koncentracije glicerola, laktata, acetata, formata, sukcinata in etanola so bile določene z uporabo HPLC sistema Agilent serije 1200, opremljenega s kolono REZEX ROA (300 × 7,8 mm, Phenomenex, Aschaffenburg, Nemčija), ki je omogočala detekcijo organskih kislin 5 mmol l -1 H2TAKO4 je bil uporabljen kot mobilna faza. Vzorce smo pripravili na naslednji način: 1 ml razredčenega vzorca smo zmešali s 45 μl 4 M NH3 (pH 10,2) in 100 μl 1,2 M MgSO4 in inkubiramo 5 minut pri sobni temperaturi, da oborimo fosfat kot heksahidrat magnezijevega amonijevega fosfata. Po 5-minutnem centrifugiranju smo 500 μl supernatanta zmešali s 500 μl 0,1 M H2TAKO4. Po 15 min inkubacijskem obdobju in 15 min centrifugiranja smo supernatant uporabili za HPLC analizo.

13 C analiza

Za merjenje fiksacije ogljikovega dioksida so bile izvedene zgoraj opisane biotransformacije v "majhnem obsegu" (1,5 ml) z uporabo popolnoma označenega NaH 13 CO3 (98 atomskih % 13 C, Isotec™, Miamisburg, OH, ZDA) namesto njegovega naravno označenega (12 C) izotopa hidrogenkarbonata. Nastale vzorce označevanja metabolitov smo analizirali z uporabo sistema TurboMass GC-MS (PerkinElmer LAS, Rodgau, Nemčija), kot je opisal Vielhauer et al. (2011). Nastali niz merilnih podatkov MS je bilo treba nadalje revidirati, da bi ločili naravno prisotne oznake 13 C od tistih, ki so bile umetno dosežene z uporabo metode popravljanja masnih izotopov, ki temelji na programski opremi (programsko orodje, ki temelji na MATLAB), ki ga je opisal Wahl. et al. ( 2004 ).


Kako se aminokisline in glukoza premikajo po celični membrani?

Aminokisline, glukoza in druge velike v membrani netopne spojine se premikajo skozi celično membrano s postopkom, znanim kot olajšana difuzija. Ta proces vključuje transmembranske beljakovine, ki odprejo majhen z vodo napolnjen kanal, skozi katerega lahko molekule prehajajo v celico ali iz nje.

Glukoza je podvržena olajšani difuziji z vezavo na protein transporter, ki nato spremeni svojo konfiguracijo, da sprosti glukozo v celico. Ta proces nadzoruje inzulin, ki stimulira membrano, da poveča število beljakovin transporterja glukoze na površini. Ko celica potrebuje več glukoze, povečano število transportnih beljakovin vodi do povečane difuzije glukoze v celico.

Vsaka od različnih aminokislin in drugih v lipidih netopnih molekul ima svoj specifični transportni protein, na katerega se veže, da bi razpršil v celico. Ti transportni proteini so odgovorni tudi za odstranjevanje presežnih molekul iz celic, kadar je to potrebno, saj je proces difuzije vedno popolnoma reverzibilen in ga nadzoruje isti transportni protein. Difuzija velja za pasivni transport, saj ne potrebuje energije, medtem ko morajo druge molekule vstopiti v celice z aktivnim transportom, ki zahteva energijo. Voda je edina spojina, ki lahko prehaja skozi celično membrano, ne da bi bila potrebna difuzija ali aktivni transport.